Spatial

原理参考 10x Genomics Support，Pipeline Demo

Spatial Omics 可以提供基因表达的空间定位

Spatial Omics

Spatial Transcriptomics 常见方法可分为以下3类 In situ：

• 荧光原位杂交（FISH）：为n种目标RNA设计n种荧光探针以进行原位杂交，根据荧光信号达成高度精确定位、定量 ----- 亚细胞水平的分辨率

  • MERFISH（MERSCOPE平台）使用多轮杂交的信号组合（一组二进制vector）为身份标识，最多可以同时支持155个基因的探测
  • CosMx成像系统原理为FISH，得到3D空间的表达（3cm3cm3cm）

• 原位测序（ISS）：探针结合靶基因后，原位扩增、荧光探针杂交（每种基因有其荧光特征条码），NGS测序 ----- 亚细胞水平的分辨率

  • 10x Xenium：对n种目标RNA设计n种padlock（padlock首尾与RNA互补，中间有ID barcode），将padlock与目标RNA进行杂交，随后通过滚换复制得到几百倍的padlock序列；随后，对padlock进行多轮荧光探针的原位杂交进行定位 ----- n种padlock的集合称为paddle，似乎可以达成 5000-gene panels ----- Xenium 的荧光探针是特定序列的寡核苷酸（针对poadlock ID），但染料只有4种颜色，故需分多轮进行杂交定位：清洗后再放入下一轮针对不同ID的荧光探针

• Spot-based（ST）原位捕获：将样本平铺在一片Spot上，裂解细胞后遗传物质落入相应的 Spot 中获得空间标签，随后进行NGS测序

  • Spot的大小为其分辨率，可以是多细胞水平（10x Visium），也可以是亚细胞水平（BGI Stereo-seq）

Xenium 对基因表达的检出灵敏度比 Visium 高 8～9 倍

一些技术问题

• 对于FISH/ISS等亚细胞水平分辨率的方法，得到序列后需要考虑如何将reads分配给细胞

  • assign给最近的细胞核
  • 可以根据 k-hoop neighbor embedding 信息进行 binning
  • 直接从染色图像中识别细胞边界（STCellbin for Stereo-seq）

• 对于 10x Visium，每个Spot可能跨越几个细胞，也可能切割一些细胞，故而如何将spots中reads分配给单个细胞也是一种挑战

  • 常见将单细胞数据作为reference，预测每个spot中的细胞组成（deconvolution）

• 如何将空间坐标（Spatial landmark）与组织照片对齐

  • Image registration DL model

BGI Stereo-seq

BGI已为其开发了 SAW workflow 以得到表达矩阵，其中的预处理方法：

• STCellbin 从ssDNA染色图像中识别细胞边界，直接将reads分配给细胞，得到 Cell bin 矩阵；无图像则只能用 Square bin 矩阵（e.g. bin50=50*50 spots）

• Spot-based 方法有极高可能发生如下问题：（EAGS对Stereo-seq数据进行平滑处理）

  • Dropout：某些基因仅在一部分细胞中高度表达，而在其余细胞中为0
  • Spot Swapping：mRNA在解离过程中向附近spot点渗出，表现为RNA被其他组织区域的探针捕获或出现在不该出现的背景区域

10x Visium

Space Ranger(10x Visium; each spot contains several cells) + Seurat.

Seurat provides methods for clustering, gene expr viewing, marker detection and ‘anchor’ between scRNA datasets (e.g., scRNA data & deconvoluted Visium data).

请参考 Spatial -- R, Scanpy/Squidpy -- Py 也提供了空间数据的处理功能

分析工具 Giotto toolbox