All Omics Overview
- 在需要准确定量的项目如ATAC、转录组中，可以加入去除PCR重复的步骤。例如scRNA使用的UMI技术，或者通过samtools/picard去除duplicate
- RNA项目可以使用RSeQC进行测序饱和度分析，以确保有效检测
- 简化xxx：缩小测序范围，e.g. WES,RRBS
- 当部分样本直接具有关联性时，就不能简单的考虑 Sample Size。假设有一部分样本(N=2)的Correlation可以计算，则着部分样本的 Effective_Sample_Size = N/[1+corr*(N-1)]
Bulk
Basic Pipelines
| Basic Pipelines | 说明 | -- |
|---|---|---|
| Genome | 组装基因组，并且预测基因；准备上传NCBI的格式 | 其它：Haplotype-based组装；结合HiC数据的组装 |
| Transcriptomics | RNA-seq | 基因的转录水平，可变剪接 |
| Proteomics | 蛋白组 | -- |
| Metabolomics | 代谢组 | -- |
| Re-seq | 对已知基因组序列信息的个体进行测序，获取SNP、InDel、SV等信息 | 群体遗传，下游：GWAS |
Metagenomics
这里有一篇流程/工具总结
病毒由于含量少，另有工具（VirSorter/VirFinder/geNomad/...checkv）
对于Binning质量，一般使用checkm/busco进行检测 --- 注意，这俩是基于数据库的，其外的污染/缺失不能被检出
cd-hit 去除冗余序列，dRep去除冗余细胞
关注环境中物种组成，或者功能基因的比例，或者物种/功能的Network，或者进行 Flux 分析
需要注意的是，由于这类研究的结果通常使用比例的方式呈现，可能会出现一些虚假的相关性，例如下例：看起来A下降了、B/C/D的丰度上涨了，它们负相关？但其实只是A变少了，其它没变 （已经有一些定量的生态学数据库？）
AAAA BB CC DD ==> AA BB CC DD
40% 20% 20% 20% 25% 25% 25% 25%
而且微生物可能是处于动态平衡中，一次采样只是得到一个瞬时snapshot；再者MAGs本质上也是一堆相似基因组的cluster，高质量MAGs之外还有些没被归类的序列可能有功能
Epi & Regulome
表观遗传修饰表观修饰可能是影响基因表达的潜在因素，常见包括：DNA甲基化、组蛋白修饰（影响染色质的暴露）、RNA甲基化... 研究话题可能与 发育、疾病、衰老 相关，例如：什么机制调控了疾病相关xx基因的过表达？
可以用实验手段直接评估调控元件的活性，例如：MPRA（大规模、并行、基因编辑）
DNA水平上的表观修饰主要是甲基化，可通过 BS-seq 获取甲基化位点信息 / 免疫沉淀富集6mA的片段(MeDIP-seq) / 测序平台直接获取。
转录调控（DNA -> RNA Transcription）一般也需要考虑细胞内DNA的3D空间距离信息（HiC）。ATAC-seq (Tn5) 标注所有开放染色质（Peaks 信号强度 = 开放程度），这些开放染色质可能是潜在的 TF-binding site (TFBS)，双峰/下凹Peak可能意味着位点被核小体/TF占据（也有可能是信号失真）。Chip-seq (超声随机断裂) 的原理是通过免疫共沉淀捕获目标蛋白、从而获得目标蛋白与DNA的互作位点，对象一般是修饰后的组蛋白/特定TF（e.g.CTCF）。CUT&Tag (Tn5 优先切割开放染色质) / CUT&RUN (MNase 对某些蛋白不敏感) 同样用于获得目标蛋白与DNA的互作，似乎更灵敏、更精细、低噪音、操作便捷，逐渐替代 Chip-seq。PRO-seq 用生物素标记原料、获得新生成的RNA，从这些被标记的RNA的位置，可知正在生成中RNA的转录起始位点(TSS)。CAGE（Cap Analysis of Gene Expression）精确捕获 mRNA 5' Cap 并测序其下游的短片段，即精确定位所有静态/稳态RNA的 TSS、CAGE tag 计数 = 启动子活性。
获知活跃的TFBS后（e.g. 与增强子活性标记 H3K27ac 共定位），如何推断其对应调控的基因？
1. 已知：增强子通常位于靶基因的±1Mb内，启动子区域（TSS ±2.5kb）的TFBS直接关联该基因
- 方法：线性距离最近的TSS（基因）
2. 3D距离最近的TSS（基因） ---- HiC 辅助
3. 假设：TF与其靶基因可能共表达
- 使用公共数据库（如GTEx、TCGA）或自有RNA-seq数据，构建共表达网络（如WGCNA）/ 筛选与TF表达高度相关的基因
4. 湿实验验证：TF扰动实验 + RNA-seq
复杂的细胞状态（信号通路、环境刺激、非编码RNA、蛋白质复合物）控制着各种酶的活性（e.g. m6A Writer/Eraser/Reader）,对RNA进行表观修饰、并通过这些修饰调控下游的剪接、翻译效率。
RNA的表观修饰（转录后修饰）有：m6A（剪接/翻译/降解），m5C（增强稳定性/影响核质转运），假尿苷（增强稳定性），A-to-I编辑。也可以通过 BS-seq / MeDIP-seq 获得甲基化修饰位点。RNA的表观修饰会影响各种调控蛋白/miRNA(e.g.与RNA互补)的结合效率，e.g. 加速招募mRNA降解相关蛋白/miRNA（mRNA稳定性），招募翻译起始因子/增强核糖体结合（mRNA翻译效率），于外显子-内含子交界处招募剪接因子，招募转运蛋白 ...
一般可以从 RNA-seq 中获取可变剪接事件 (rMATS)、其突变信息（ANNOVAR）。 关于其调控机制，可通过 SpliceAid 数据库预测剪接因子的结合位点，或使用 CLIP-seq (蛋白-RNA互作) 验证剪接因子（e.g. SRSF1）的结合位点（即调控剪接的顺式元件）。
翻译调控（RNA -> Peptide Translation）的研究。Ribo-seq 可获得与核糖体结合的RNA片段（正在翻译），其定位(ribosome footprints)的密集程度暗示翻译的效率：Translation Efficiency = Ribo-binding Reads (Ribo-seq) / mRNA reads (RNA-seq)
关于 Ribo-seq，可以联合其它组学：
- 翻译效率是否正常？ --- （active mRNA） v.s. （蛋白组）
- mRNA稳定但翻译抑制？寻找相应的转录后修饰 --- （active mRNA） v.s. （RNA-seq / BS）
示例：一个研究问题
Alternative Promoter --> TSS 变化 --> pre-mRNA 变化，如何影响翻译效率？
- 长/短/序列不同的5'UTR --> 新增/减少 蛋白结合位点
- 可变剪接 --> 不同的外显子 --> 蛋白结构/功能改变
- 降解/翻译起始/.... 参考上文 ‘表观修饰’ 段
- 在上游增加 ORF，翻译后核糖体脱离，抑制主ORF的翻译
- 一些可行的ML工具
Single-Cell & Spatial
| -- | 说明 | -- |
|---|---|---|
| Single_Cell | Reads 带有 Cell Barcode 和 UMI | -- |
| Spatial | Reads 带有空间信息 | -- |